Home Page Image
DESPRE NOI  
COLECTIVE DE LUCRU  
REZULTATE VALORIFICATE
PROIECTE DE CERCETARE
PERSOANE DE CONTACT

Testele de genetica moleculara in talasemie

STRATEGIA DE INVESTIGARE A MUTATIILOR TALASEMICE se refera la “cautarea” modificarilor produse in genele globinice normale ce au dus la transformarea lor in gene talasemice.

            Majoritatea α-talasemiilor sunt consecinta unor deletii ale genelor α-globinice, in timp ce β-talasemiile sunt produse ca rezultat al mutatiilor punctiforme aparute in ADN la nivelul genelor β-globinice.
In scopul identificarii mutatiilor b-talasemice se procedeaza la urmatoarele etape:
dsa recoltarea de sange periferic→extractie ADN din sange→prelucrare ADN→aplicarea metodelor moleculare bazate pe tehnica PCR pentru genele de interes

            Prin metode de biologie moleculara, in laboratorul Genom Uman din Institutul de Genetica al Universitatii Bucuresti se realizeaza identificarea mutatiilor produse la nivelul genelor de interes. Mai intai se identifica prezenta sau absenta vreunei modificari in gena studiata, aceasta se realizeaza cu ajutorul metodei DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis – electroforeza in gel cu gradient de denaturare). Aceasta metoda permite aflarea daca in gena s-a produs vre-o mutatie, chiar si o schimbare a unei singure nucleotide (A,T,G,C) si locul unde se afla aceasta mutatie.
Identificarea si caracterizarea directa a mutatiilor se realizeaza prin amplificare specifica a alelei mutante (ARMS-PCR, Amplification Refractory Mutation System-PCR) sau analiza situsului de restrictie (PCR-RFLP, PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism). Aceste metode ne indica exact mutatia produsa in gena studiata, fiind si metode de verificare, absolut necesare intr-un diagnostic molecular.
Aceasta metodologie s-a dovedit a fi cea mai eficienta si mai putin costisitoare. Este avantajoasa prin sensibilitatea inalta si nu necesita marcare radioactiva sau fluorescenta, deci nu este nociva si poate fi aplicata in orice identificare de mutatii punctiforme.
             Studiul molecular in vederea aplicarii unor metode de diagnostic molecular al b-talasemiilor se realizeaza pe material reprezentat de ADN. Prima etapa in analiza moleculara a unor boli genetice este izolarea si obtinerea unui ADN de foarte buna calitate, nedegradat si inalt purificat.
            Pentru studiul molecular al mutatiilor genice in talasemie se folosesc probe de sange periferic de la pacienti diagnosticati hematologic cu diferite forme de talasemie.

STUDIUL COMPARATIV AL MODELELOR ELECROFORETICE IN GEL CU GRADIENT DE DENATURARE (DGGE) DATE DE MUTATII DIFERITE IN GENA b-GLOBINEI

Pentru a identifica daca exista vre-o modificare in gena b-globinei la persoanele cu diferite forme de b-talasemie sau suspectate a fi purtatori, se realizeaza “scanarea” intregei gene b-globinei prin metoda DGGE.
fdsa

Pentru localizarea mutatiilor b-talasemice in gena b-globinei, cinci fragmente ale acestei genei (Fr.F; Fr.I; Fr.II; Fr.III si Fr.IV) sunt amplificate prin PCR si ulterior analizate prin DGGE.

 

fdsaTestarea fragmentului F (de la regiunea netranslata 5' UTR pana la exonul I) permite analiza urmatoarelor mutatii: (i)ale elementelor reglatoare promotoare: -101 (C-T) ; -92 (C-T) ; -87 (C-G) ; -87 (C-T) ; -86 (C-A) ; -31 (A-C) ; -30 (T-A) si (ii) ale regiunii netranslate: CAP +10 (-T) ; CAP +20 (C-T) ; CAP +22 (G-A) ; CAP +33 (C-G). In acest fragment F mai poate fi identificat un polimorfism (+20 C-T) care este lincat cu mutatia b-talasemica IVS II-745 (C-G). Un alt polimorfism in gena b-globinei ce nu exprima alele mutante, identificat in acest fragment, este polimorfismul cd 2 (C-T).

Testarea fragmentului I (cuprinde o parte din 5' UTR si exonul I) permite analiza mutatiilor de translatie a ARN: (i) mutatii ce produc alterarea cadrului de citire (frameshift), cele mai frecvente fiind: cd 1 (-G) ; cd 5 (-CT) ; cd 6 (-A); cd 8 (-AA). Si in acest fragment poate fi identificat polimorfismul +20 (C-T) lincat cu mutatia IVS II-745 (C-G) si polimorfismul cd 2 (C-T) ce nu determina alele mutante.

Testarea fragmentului II (cuprinde intronul I exonul II) permite analiza pentru mutatii de procesare a ARN ce includ mutatiile de jonctiune ale situsurilor de splicing (splice-junction) : IVS I-1 (G-A) ; IVS II-1 (G-A) ; IVS I–44 pb ; IVS I-130 (G-C), mutatii in situsuri consens de splicing : IVS I-5 (G-T) ; IVS I-5 (G-A) ; IVS I-6 (T-C), mutatii ce produc situsuri criptice de splicing : IVS I-110 (G-A) ; IVS I-116 (T-C), mutatii de translatie ARN ce produc codoni nonsens, cele mai frecvente fiind: cd 6 (GAG-TAG) ; cd 39 (CAG-TAG) ; cd 121 (GAA-TAA).

Investigarea fragmentului III (cuprinde o mare parte din intronul II) se va face prin metoda PCR-RFLP. Mutatiile produse in acest fragment sunt mutatiile de procesare a ARN ce includ mutatiile ce produc situsuri de splicing criptice in intronul II. Cea mai frecventa mutatie in acest fragment este IVS II-745 (C-G).

Testarea fragmentului IV (cuprinde exonul III si regiunea netranslata 3' UTR). Mutatiile produse in acest fragment sunt mutatiile de procesare a ARN ce includ mutatii ale clivarii ARN din regiunea 3' UTR – semnalul poli (A) :  AATAAA-AATGAA si mutatii terminale: +1480 (C-G) ; cd +90 (-13 pb).

IDENTIFICAREA SI CARACTERIZAREA DIRECTA A MUTATIILOR b-TALASEMICE PRIN ARMS-PCR SI PCR-RFLP
Urmatoarea etapa, ulterioara aplicarii tehnicii DGGE, este aceea de confirmare si caracterizare directa a mutatiilor talasemice prin tehnica ARMS-PCR sau RFLP-PCR. Aceaste metode se aplica acelor probe care au manifestat o schimbare in mobilitatea electroforetica fata de normal.
fd            Metoda ARMS-PCR, utilizata pentru identificarea mutatiilor alelice la pacienti cu b-talasemie, implica folosirea a 4 primeri intr-un amestec de reactie. Doi dintre primeri sunt primeri control care amplifica un segment de ADN la o anumita distanta de locul mutatiei investigate, astfel incit sa nu interfere cu amplificarea fragmentului de ADN produs de ceilalti doi primeri: primerul ARMS care este specific pentru secventa mutanta a alelei si primerul complementar cu aceeasi secventa atit in ADN normal cit si in ADN mutant.

Au fost selectate oligonucleotidele primer pentru a detecta cele mai frecvente mutatii in populatia Romaniei. Primerii ARMS detecteaza direct aceste mutatii talasemice prin amplificarea unui fragment caracteristic.

Mutatiile punctiforme care, creaza sau desfiinteaza un situs de restrictie, pot fi analizate prin digestia produsului amplificat cu enzime de restrictie. Produsul genic amplificat este supus digestiei enzimatice cu endonucleaze de restrictie pentru identificarea situsurilor in care apar mutatii.

Existenta situsurilor depinde de faptul ca modificarile in secventa de baze altereaza fenotipul (M-ADN modificat, N-ADN normal).
as

O schimbare chiar a unei singure nucleotide in ADN afecteaza situsul de restrictie a unei enzime de restrictie si va cauza o reducere corespunzatoare sau o crestere in marime a fragmentelor de restrictie in care se afla, astfel apare polimorfismul lungimii fragmentelor de restrictie (RFLP). Pentru diagnosticul molecular al b-talasemiei se testeaza polimorfismul situsurilor de restrictie Hpa I, Mbo I, Mae I, Dde I, Mst II, Rsa I din gena β-globinei.
as

Prin aceste metode se stabileste diagnosticul molecular, starea de homozigot (bolnav) sau heterozigot (purtator) al β-talasemiei, se identifica mutatia exacta care a produs boala si se stabileste prognosticul bolii talasemice.

O metoda eficienta de ultima ora, aplicata cu succes in diagnosticul talasemiilor este REAL TIME PCR. Aceasta metoda este o varianta de PCR cantitativ, realizata cu un aparat numit thermocycler cu detectie fluorescenta care se utilizeaza pentru screening de mutatii si polimorfisme.

as

 

 
 
   
     
Acest site este sustinut prin finantare din proiect CEEX 49/2006